來自西北農林科技大學的研究人員成功利用鋅指切口酶（zinc-finger nickases,ZFN）介導將溶葡萄球菌素（lysostaphin）基因插入到β-酪蛋白（beta-casein）基因座，由此構建出了活產基因靶向性克隆牛。這一突破性的研究成果發(fā)表在10月14日的《自然通訊》（Nature Communications）雜志上。生物通 www.ebiotrade.com
領導這一研究的是西北農林科技大學的張涌（Yong Zhang）教授，其多年從事哺乳動物發(fā)育生物工程理論和技術研究。是國家級“有突出貢獻專家”。
ZFN是一種適用于基因組工程操縱、實現定向突變的強有力的工具。ZFNs切割DNA，在基因組中生成位點特異性雙鏈斷裂(DSBs)?；蛲ㄟ^非同源末端連接(NHEJ)修復雙鏈斷裂，往往會在連接斷點導入短的插入或缺失(indels)，或是通過同源重組修復（HDR）拷貝姐妹染色單體忠實地修復原始序列。盡管非同源末端連接是高等真核細胞和生物體主要的雙鏈斷裂修復信號通路，目前研究人員利用了這兩種信號通路來實現定點基因組修飾。生物通 www.ebiotrade.com
當前，ZFNs被廣泛地應用于基礎研究、生物技術和醫(yī)學領域，但由于不可避免地生成雙鏈斷裂以及非同源末端連接的易出錯性，利用可編程核酸酶進行基因組工程操縱受到限制。并且，這些可編程核酸酶往往會在高度同源的位點誘導出隨機生成及不需要的缺失。而且核酸酶誘導太多脫靶雙鏈斷裂對細胞有害。此外，要正確地分離出基因靶向細胞也不是件容易的事情。
克服這些局限的一種潛在策略就是，靶向性導入到包含一個單鏈斷裂（SSB）或切口的DNA中。像雙鏈斷裂一樣，單鏈斷裂/切口理論上可以刺激同源重組修復信號通路。與雙鏈斷裂相比，切口或SSB不是非同源末端修復的底物。因此，靶向性SSB有潛力將修復限定至同源重組修復信號通路。生物通 www.ebiotrade.com
溶葡萄球菌素可由溶血性葡萄球菌自然生成，已有人提出用它來進行全身性治療溶血性葡萄球菌感染。在小鼠模型中，溶葡萄球菌素已被證實能夠對抗溶血性葡萄球菌引起的乳腺炎。有研究報道，乳汁中表達溶葡萄球菌素的轉基因牛能夠抵抗溶血性葡萄球菌乳房感染。然而在體外采用哺乳動物細胞生成的溶葡萄球菌素由于糖基化有可能發(fā)生蛋白質失活。因此，修改編碼序列生成Gln125,232-溶葡萄球菌素確保了兩個潛在糖基化位點被移除。這可以防止蛋白質糖基化并恢復部分蛋白質活性。
在新研究中，研究人員的目的旨在通過在牛胚胎成纖維細胞內將外源性Gln125,232溶葡萄球菌素基因插入到β-酪蛋白基因座中，進行有效、可重現的基因靶向，從而使得基因靶向牛的乳腺能夠生成溶葡萄球菌素蛋白。生物通 www.ebiotrade.com
研究人員隨后證實了，在牛胚胎成纖維細胞中將ZFNickases靶向內源β-酪蛋白基因座，通過同源重組修復刺激可添加溶葡萄球菌素基因。他們發(fā)現，ZFNickase處理細胞可成功用于體細胞核移植，生成了活產的基因靶向牛（gene-targeted cow）。并且，這些基因靶向牛的乳汁中分泌溶葡萄球菌素，體外分析證實這種牛奶能夠殺死金黃色葡萄球菌。研究人員表示，在這一策略上取得的成功將推動新的轉基因技術讓農業(yè)和生物醫(yī)學獲益。